如何去除巨噬細胞？

    如何去除巨噬細胞？目前清除巨噬細胞常用的是clodronate liposomes，由荷蘭的Nico  van  Rooijen教授研發(fā)。目前已成立公司Liposoma B.V.

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去除巨噬細胞（depletion of macrophages）是研究巨噬細胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije University的Nico van Rooijen教授開發(fā)的一款Clodronate liposomes，可以利用巨噬細胞的內(nèi)吞機制，將膜不通透性的氯磷酸（Clodronate）帶入細胞內(nèi)，從而達到去除巨噬細胞的目的。

作用原理：

兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體，磷脂雙分子層中間通過水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過程中被包裹進磷脂雙分子層之間的水相中（如圖1）。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體的磷脂雙分子層。隨著脂質(zhì)體被巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來，并累積在細胞內(nèi)，當(dāng)其達到一定濃度時，巨噬細胞將會受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而進入凋亡過程（如圖2）。從死亡的巨噬細胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細胞外的半衰期極短（大約15min），可以通過泌尿系統(tǒng)排除體外。

 

圖1：氯磷酸-脂質(zhì)體（Clodronate liposomes）復(fù)合物。在脂質(zhì)體的形成過程中氯磷酸通過溶解在水溶液中被包裹進磷脂雙分子層之間的水相中。

 

圖2：巨噬細胞清除原理。包裹著氯磷酸（方塊）的脂質(zhì)體通過巨噬細胞的內(nèi)吞作用進入細胞，與溶酶體（L）融合后，在磷脂酶(箭頭)的作用下，釋放出氯磷酸，當(dāng)細胞內(nèi)氯磷酸的濃度達到一定濃度，就會對巨噬細胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，從而迫使其進入細胞凋亡。

產(chǎn)品性質(zhì)：

1ml脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na₂HPO₄，10 mM NaH₂PO₄，140 mM NaCl。

脂質(zhì)體體內(nèi)注射：

隔日尾靜脈注射200μl Clodronate liposome，根據(jù)實驗要求制定注射日程。通過免疫組化或流式檢測巨噬細胞去除效率。

尾靜脈注射方法：

（1）將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi)，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布,一般采用左右兩側(cè)的靜脈；

（2）將紗布浸泡于約70度的溫水中，拿出后包裹尾巴，以達到使尾部血管擴張及軟化表皮角質(zhì)的目的；

（3）行尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1ml針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進針，開始注入藥物時應(yīng)緩慢，仔細觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入藥物。

（4）有的實驗需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2min，止血。

效果展示：案例一：案例二：

左圖顯示的是正常脾臟細胞中陽性巨噬細胞的染色結(jié)果。右圖為Clodronate-liposome注射2天后觀察的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)只剩下少量的巨噬細胞。左圖表示正常肝臟細胞中陽性的Kupffer細胞。右圖表示Clodronate-liposomes注射2天后，肝臟Kupffer細胞染色結(jié)果，Kupffer細胞基本被清除。

FAQ:

Q:收到Clodronate liposomes后該如何操作？A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后，如果不能馬上使用，需要放置在4℃冰箱。禁止凍存！使用時作為原液使用，不能進行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用，需要恢復(fù)到室溫才能進行注射。

Q: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細胞清除？A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細胞的清除，但是這種方法比較適合體內(nèi)實驗。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中，從死亡細胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏”出來氯磷酸，會一直存在于培養(yǎng)基中，但是在體內(nèi)，氯磷酸的半衰期很短，很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會進入細胞也不會進入脂質(zhì)體，但是一旦他們在培養(yǎng)基中積累就會慢慢地進入細胞中。

Q:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了，是什么原因？A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時間后會發(fā)生沉降。如果在很長一段時間內(nèi)需要一次注射多只動物，那么脂質(zhì)體便會在注射器中發(fā)生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，只注射的計量與后一只注射的計量就會發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后，沒有恢復(fù)到室溫。

Q:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？A：這個可能是受到細菌的污染，體內(nèi)清除巨噬細胞后會增加例如病毒粒子，細菌或者酵母感染的幾率。

Q:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細胞并沒有*消失？A：大鼠中成熟的巨噬細胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細胞也是ED1+，但是呈現(xiàn)ED2-。因此，所有ED2+的細胞都可以被*清除，但是ED1+的細胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細胞的比例。

Q: Clodronate liposomes沒有達到期望的效果？A：氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn)，每批次都會對氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進行檢測，確保無誤后才會銷售給客戶。另外，脂質(zhì)體容易收到溫度的影響。正確的運輸和儲存方式是4~8℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起，需要在3個月內(nèi)使用完，不然有可能會影響使用的效果。

Q:在靜脈注射時，能不能增加注射的體積？A：靜脈注射時需要依據(jù)動物的體重，不能超過0.1ml/10mg，但是進行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點的容量進行決定。